IPS诱导肠类器官的培养分为三个主要阶段：人多能干细胞培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官培养。本文将专注于第三阶段——类器官培养，预计持续时间为14到28天。

一、准备工作

在类器官培养中，需要准备以下试剂和耗材：人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）、基质胶（低因子、无酚红，abs9495）、离心管、细胞培养板等。以下是具体的试剂组分情况：

• 类器官培养基 A: 100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B: 250ml
• 原代组织消化液 C: 30ml
• 类器官传代消化液 D: 30ml
• 组织保存液 E: 100ml
• 类器官冻存液 F: 20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G: 250ml

二、操作流程

1. 加胶-点板-加入培养液

这一环节是整个原代操作的关键，具体步骤如下：

1. **准备工作**：基质胶需在4℃冰箱中融化过夜；枪头和离心管应在-20℃下预冷至少半小时。
2. **接种要求**：在24孔板中，每孔加入25μL基质胶和500-750μL类器官培养基。
3. **接种密度**：建议的比例为25:1（基质胶总体积与细胞团总体积）。如果不确定，可以使用300μL基质胶。
4. **加胶和混合**：在金属冰盒或冰上进行，加入基质胶前需确保吹打混匀，以避免气泡生成。
5. **培养液添加**：将培养板放入37℃培养箱中，固化40-60分钟后，添加培养基以促进类器官的生长。通常在10-14天后，直径可达200μm-500μm，可进行传代操作。

2. 类器官传代

传代分为两种情况，针对数量较多或体积较大的类器官，遵循以下步骤：

1. **类器官收集**：使用吸管吸去培养基，轻柔加入4℃的传代培养缓冲液，吹散基质胶，并收集在离心管中。
2. **洗涤和离心**：加入传代培养缓冲液达到14ml，静置或低温处理以软化基质胶，进行离心处理以分离细胞团和基质胶。
3. **消化和重悬**：添加消化液进行适当消化，避免生成单细胞。处理后再次离心，弃去上清液。
4. **重新接种**：根据密度要求，将细胞团与基质胶混合后点板，进行后续培养。

三、冻存与复苏

1. 冻存要领

类器官在指数生长期进行冻存，选择传代后的第3-4天，通常选择直径为100μm-200μm的类器官进行处理。步骤包括：

1. 类器官的收集与洗涤，准备冻存液。
2. 轻柔混合后进行梯度冻存，确保DMSO的处理不超过时间限制。

2. 复苏步骤

复苏时，务必快速解冻，并在超净台内进行消毒和操作，包括重悬类器官并添加适量的缓冲液进行离心，最后进行接种和培养。

关键注意事项

在操作过程中，严密监控基质胶的使用、细胞密度和生长因子的活性，以确保类器官培养的成效。此外，需定期检查以防止污染，确保实验的成功性。

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